Controllo della salute degli organi solidi dopo trapianto facendo uso di DNA senza cellula

I sistemi diagnostici basati su cfDNA hanno potuto rendere la biopsia del tessuto obsoleta
Biopsie costose e dilaganti del tessuto per individuare rifiuto dell'allotrapianto dopo trapianto per presentare le numerose limitazioni. Le analisi basate su DNA senza cellula (cfDNA) — frammenti di circolazione di DNA hanno liberato dalle celle, tessuti e gli organi come subiscono la cella naturale morte-sono stati studiati intensivamente recentemente e potrebbero infine migliorare la nostra capacità di individuare il rifiuto, il mezzo più presto cambia in gestione e perfino migliora la sopravvivenza a lungo termine degli organi trapiantati.
Le analisi di CfDNA che aggirano l'esigenza del intero-genoma che ordina (WGS) e l'esigenza di conoscenza a priori dei genotipi erogatori e/o riceventi presentano i vantaggi logistici potenti e sono attualmente nell'ambito dell'esame accurato clinico. Inoltre, migliorare la conoscenza della cinetica organo-specifica di trapianto seguente donatore-derivato del cfDNA (dd-cfDNA) inoltre ha contribuito ad ottimizzare queste analisi. I laboratori inoltre hanno introdotto i metodi alternativi per la misura del dd-cfDNA, quali reazione a catena digitale (PCR) della polimerasi della gocciolina ed i modelli organo-specifici di metilazione del DNA. Come tale, il campo dei sistemi diagnostici come minimo dilaganti basati sopra cfDNA sempre più sta promettendo, l'un giorno potenzialmente che sostituisce le biopsie tradizionali del tessuto.
IL RUOLO DI CFDNA NEL RIFIUTO DELL'ORGANO
Il rifiuto, riferentesi alla lesione di un organo donato causato dal sistema immunitario del destinatario, può causare la disfunzione dell'allotrapianto e perfino la morte paziente. Il rifiuto cellulare acuto mediato cellula T (ACR) si presenta il più spesso entro i primi 6 mesi di post-trapianto (1). Il ACR comprende l'accumulazione delle cellule T di CD8+ e di CD4+ nello spazio interstiziale dell'allotrapianto mentre il sistema immunitario del destinatario riconosce gli antigeni sull'organo donato come straniero. Queste cellule T iniziano una cascata immune che infine conduce alla morte programmata delle cellule (apoptosi) delle cellule mirate a. Mentre queste cellule muoiono, il DNA genomico è fenduto ed i frammenti del dd-cfDNA, misuranti circa 140 coppie di basi di (bp) di lunghezza, sono liberati per unire lo stagno di cfDNA ricevente nel sangue ed infine sono espelsi nell'urina (2).
Il cfDNA di circolazione recentemente è stato fatto leva come uno strumento diagnostico per sostituire le biopsie dilaganti in altre aree di medicina, compreso analizzare le sequenze di DNA fetali all'interno della circolazione materna per identificare le anomalie genetiche in utero e l'ordinamento del DNA di circolazione liberato dalle cellule del tumore per identificare le mutazioni legate al cancro. In entrambi questi casi come pure nel trapianto, l'ordinamento di alto-capacità di lavorazione che identifica e quantifica le differenze di sequenza del DNA distingue fra le due popolazioni differenti di cfDNA derivate dalle fonti distinte (2). Tre caratteristiche di cfDNA le rendono un biomarcatore non invadente eccellente del candidato per individuare il rifiuto dopo trapianto solido dell'organo: Può essere ottenuto da un tiraggio semplice del sangue, dalla sua concentrazione misurata esattamente e dalla sua sequenza nucleotidica identificata facilmente. Facendo uso di cfDNA come biomarcatore per il ACR è inoltre vantaggioso poiché è derivato dalle cellule danneggiate dell'organo donato e quindi dovrebbe rappresentare una misura diretta della morte delle cellule che accade nell'allotrapianto. Ancora, il cfDNA mantiene tutte caratteristiche genetiche del DNA genomico originale, permettendo il materiale genetico liberato dall'organo donato da differenziare dal cfDNA derivato dalle cellule del destinatario che stanno subendo gli apoptosi naturali (3).
Il frequente e monitoraggio accurato della salute dell'allotrapianto è essenziale per la sopravvivenza a lungo termine dei destinatari del trapianto. Per trapianto cardiaco (HT), la biopsia endomyocardial (EMB) è la parità aurea corrente per individuare il ACR (4). Tuttavia, EMBs è costoso con le limitazioni significative, molte di cui sono comuni a tutto l'organo biopsiano (5-7). Inoltre, la natura dilagante di EMBs mette i pazienti del GH a rischio delle complicazioni (6,8,9).
Purtroppo, metodi non invadenti attualmente disponibili compreso ecocardiografia o la specificità sufficiente di mancanza di (MRI) di imaging a risonanza magnetica e sensibilità per individuare attendibilmente rifiuto (10-13). a biomarcatori basati a sangue, quale cfDNA, rappresentano un'alternativa di promessa che potrebbe essere implementata prontamente in pratica clinica (14-17).
CINETICA DI CFDNA DURANTE QUIESCENZA ED IL RIFIUTO
Poiché il cfDNA proviene dal processo naturale degli apoptosi, tutti gli individui hanno livelli rilevabili di cfDNA nel loro sangue (18). Per gli individui in buona salute, la maggior parte di cfDNA di circolazione viene dalle cellule ematopoietiche che hanno subito la morte naturale relativa al volume d'affari cellulare. I livelli di cfDNA oscillano per le ragioni multiple compreso l'infezione, la chirurgia, il trauma, o persino l'esercizio esauriente (2,19). Di conseguenza, sviluppare ad un'analisi basata cfDNA per individuare il rifiuto richiede la valutazione della cinetica prevista del rilascio dd-cfDNA nel post-trapianto della circolazione del destinatario. Questa considerazione è particolarmente importante poiché il rilascio di post-trapianto dd-cfDNA è col passare del tempo organo-specifico (20-22).
Per esempio, a 1 post-GH del giorno il livello medio di dd-cfDNA è 3,8 ± 2,3% (20). Tuttavia, entro i 7 giorni il livello di dd-cfDNA è diminuito rapidamente e rimane coerente basso (<1> al contrario, i destinatari dei trapianti bilaterali del polmone sono stati trovati per avere una frazione media dd-cfDNA 26 di ± 14% il primo giorno postoperatorio. Ancora, la riduzione del dd-cfDNA è stata caratterizzata dai livelli di dd-cfDNA che sono diminuito rapidamente nella prima settimana ma d'altra parte è stata rallentata e generalmente è stata rimanere a 1%-3% (21). Tuttavia, simile ai trapianti del rene e del cuore durante l'episodio del rifiuto acuto, il livello di dd-cfDNA è aumentato significativamente, scalando ad una media di 14%-15%.
Le differenze nella massa di tessuto e nei tassi di volume d'affari cellulare rappresentano questa variabilità nei livelli di post-trapianto in anticipo liberato dd-cfDNA e durante la quiescenza. Per esempio, le differenze nel fare circolare i livelli dd-cfDNA nei trapianti tranquilli del unico polmone e bilaterali possono essere spiegate in secondo luogo tramite la differenza nel volume d'affari cellulare, essendo 107 contro 58 cellule/, rispettivamente (21). Al contrario, in un cuore trapiantato tranquillo, il tempo di rotazione cellulare è in secondo luogo soltanto 8 cellule/(21-23). Quindi, una comprensione dei livelli previsti di dd-cfDNA connessi con un organo solido dato è essenziale per facilitare lo sviluppo delle analisi organo-specifiche che individuano il rifiuto. Una volta che la cinetica del rilascio del cfDNA per un organo particolare è capita, parecchi metodi esistono per la misura della quantità relativa di dd-cfDNA.
STRATEGIE PER DISTINGUERE DESTINATARIO CONTRO DONOR-DERIVED CFDNA
Sesso-disadattamento del Donatore-destinatario
Per i trapianti di organi in cui il donatore è maschio ed il destinatario è femminile, i laboratori possono fare leva questo disadattamento del sesso per calcolare i livelli dd-cfDNA dall'interno dello stagno totale del cfDNA del destinatario (17). I ricercatori in primo luogo hanno dimostrato la fattibilità di questo approccio in campioni di urina prelevati dai destinatari renali femminili del trapianto che avevano ricevuto un rene dai donatori maschii e quando hanno avvertito i livelli elevati dimostrati rifiuto di dd-cfDNA in loro urina che specificamente ha contenuto le regioni trovate sul cromosoma Y (17). Sebbene questo approccio tenga conto la diagnosi sicura del rifiuto nell'allotrapianto, il sesso-disadattamento fra il donatore ed il destinatario è relativamente raro e non universalmente applicabile.
Differenze di sequenza del DNA del Donatore-destinatario
Un trapianto di organi può anche essere considerare come un trapianto del genoma, poichè le cellule all'interno di un organo trapiantato contengono le informazioni genetiche del suo donatore. Come tale, il concetto della dinamica (GTD) del trapianto del genoma conta sulla presenza di differenze genetiche fra il donatore ed il destinatario ad un luogo particolare, che poi può essere fattoe leva per identificare l'origine del cfDNA di circolazione (20-24). Nel migliore dei casi, il destinatario sarebbe omozigotico per una singola base (per esempio, aa) ed allo stesso luogo il donatore sarebbe omozigotico per una base differente (per esempio, GG).
Dato l'eterogeneità genetica fra gli individui, decine di migliaia di luoghi potenzialmente informativi attraverso il genoma possono essere interrogati facendo uso di alto-capacità di lavorazione che ordina per distinguere il dd-cfDNA da cfDNA ricevente (20,24). Questo concetto in primo luogo è stato illustrato facendo uso dei campioni contati dai donatori cardiaci per ottenere i genotipi erogatori a priori per ogni accoppiamento del donatore-destinatario. Dopo l'estrazione e l'ordinamento del cfDNA da ogni destinatario, la frazione delle molecole donatore-specifiche era risoluta. In campioni prelevati durante o immediatamente prima dell'evento biopsia-provato di rifiuto, la proporzione di singoli polimorfismi donatore-specifici (SNPs) del nucleotide è stata trovata per aumentare <1>da 3%-4% (24).
Questo studio retrospettivo iniziale ora è stato convalidato futuro. I destinatari adulti e pediatrici del trapianto del polmone e del cuore sono stati reclutati ed i genotipi per ogni paio del donatore-destinatario sono stati ottenuti attraverso il gruppo di lavoro con una media di 53.423 indicatori informativi di SNP identificati (20). L'individuazione tempestiva globale e del rifiuto acuto era superiore a quella di AlloMap, il primo alimento e droga l'approccio non invadente Amministrazione-approvato ad individuare il ACR dopo il GH basato sull'analisi del transcriptome (25).
La ricerca inoltre ha indicato che il gruppo di lavoro non solo fornisce le informazioni su un innesto ma anche sul virome di un paziente e lo stato globale di immunosoppressione. Ciò rappresenta un vantaggio potenzialmente grande impossibile da ottenere da altre analisi (26-28).
Tuttavia, il gruppo di lavoro affronta le sfide che potrebbero impedirla essere implementatoe ordinariamente nella pratica clinica. Per esempio, mentre le informazioni genetiche di un destinatario possono essere ottenute facilmente, questo non è sempre vero per un donatore. Inoltre, il gruppo di lavoro è costoso, ad alto contenuto di manodopera e che richiede tempo.
Un metodo alternativo impiega un pannello di SNPs polimorfico genotyped identificato all'interno dello stagno di cfDNA estratto quindi che elimina l'esigenza di conoscenza a priori del genotipo specifico di un donatore (29). A differenza dei trapianti del fegato e del rene, che si presentano spesso fra gli individui strettamente connessi, le paia del donatore-destinatario per cuore ed i trapianti del polmone non sono tipicamente relative. GTD richiede la genotipizzazione sia del destinatario che del donatore del trapianto. Tuttavia, in pratica, le informazioni erogarici di genotipo sono spesso non disponibili. Qui, affrontiamo questa edizione sviluppando un algoritmo che stima i livelli dd-cfDNA in assenza di un genotipo erogatore. Il nostro algoritmo predice il rifiuto dell'allotrapianto del polmone e del cuore con un'accuratezza che è simile a GTD convenzionale. Ancora abbiamo raffinato l'algoritmo per trattare i destinatari ed i donatori strettamente connessi, uno scenario che è comune nel trapianto del midollo osseo e di rene. Indichiamo che è possibile stimare il dd-cfDNA nei pazienti sottoposti a trapianto del midollo osseo che sono indipendenti o che sono fratelli germani dei donatori, facendo uso di un modello markoviano nascosto. Di conseguenza, gli algoritmi sono stati sviluppati per i trapianti del polmone e del cuore che suppongono che il genotipo del donatore si presenta alla stessa frequenza della popolazione in genere. Sulla base di queste frequenze e del confronto al genotipo conosciuto del destinatario, la frazione del dd-cfDNA può essere stimata attendibilmente dallo stagno totale di cfDNA isolato dal campione del plasma di un destinatario.
Nel caso di trapianto del polmone, questo modello del unico genoma, una volta confrontato alla metodologia facendo uso sia dei genotipi erogatori che riceventi, è stato trovato per fornire le frazioni comparabili del dd-cfDNA. Tuttavia, quando i ricercatori hanno applicato questo stesso algoritmo al GH, i livelli stimati di dd-cfDNA non sono stati correlati forte quanto nei trapianti del polmone. Ciò ha potuto essere collegata con gli importi assoluti più bassi del dd-cfDNA presenti dopo il GH. Ciò è un altro esempio della cinetica organo-specifica del cfDNA che può influenzare i risultati di analisi e deve essere considerata (30).
Nel caso di trapianto renale, gli studi prospettivi sono stati intrapresi accertare dell'utilità dei livelli dd-cfDNA, identificata facendo uso di SNPs donatore-specifico conosciuto, come indicatore possibile per il rifiuto. In uno tale studio, 384 destinatari del rene sono stati reclutati da 14 siti clinici per fornire i campioni di sangue ad intervalli preveduti ed all'epoca di biopsie clinicamente indicate (31). In generale, lo studio ha messo a fuoco sulla correlazione fra l'istologia in 107 esemplari di biopsia da 102 pazienti ed i livelli di dd-cfDNA trovati nei campioni abbinati del plasma. Più specificamente, 27 campioni di biopsia da 27 pazienti con il rifiuto attivo sono stati ottenuti con 80 campioni di biopsia da 75 pazienti senza rifiuto attivo.
In questo studio, il rifiuto attivo ha compreso il rifiuto anticorpo-mediato acuto (AMR), Amr cronico ed ACR. L'analisi utilizzata in questo studio ha impiegato un taglio di 1% per la frazione del dd-cfDNA per indicare la presenza o l'assenza di rifiuto attivo ed è stata trovata per avere la specificità di 85% (ci di 95%, 79%-91%) e sensibilità di 59% (ci di 95%, 44%-74%). La sensibilità di questa analisi era maggior per discriminare fra il Amr attivo ed assente, poichè l'uso di un taglio del dd-cfDNA di 1% è stato trovato per avere una specificità di 83% (ci di 95%, 78%-89%) e sensibilità di 81% (ci di 95%, 67%-100%). Considerevolmente, in entrambi i casi, la sensibilità è diminuito sostanzialmente quando la frazione del dd-cfDNA ha superato 3%.
Per migliorare la specificità e la sensibilità ad un'di un'analisi basata cfDNA non invadente per individuare il rifiuto seguire il trapianto renale, i ricercatori inoltre hanno esaminato la quantità assoluta di dd-cfDNA (32-33). Interrogando la quantità assoluta di dd-cfDNA, uno può eliminare i cambiamenti artificiali nella frazione del dd-cfDNA dovuto gli aumenti nei livelli totali del cfDNA causati dagli eventi di non rifiuto, quali l'infezione, il trauma, o l'esercizio, potenzialmente creante un'analisi più accurata.
Per studiare questa possibilità, uno studio ha impiegato 32 varianti informative (CNVs) di numero di copia basato sulle frequenze della popolazione, rispetto alle percentuali relative di erogatore e destinatario SNPs ai luoghi dati (32). Tutto il CNVs non assente all'interno del genoma di un destinatario ma il presente all'interno del cfDNA estratto quindi è stato presupposto per rappresentare il dd-cfDNA.
Interessante, mentre la specificità e la sensibilità sono migliorato globalmente con l'uso dei livelli assoluti dd-cfDNA, questa analisi inoltre ha avuta una maggior capacità di distinguere fra la presenza e l'assenza di Amr dell'attivo, rispetto ai casi del ACR dell'attivo. Inoltre, i livelli della creatinina del siero non erano sufficienti nel discriminare fra il rifiuto attivo e la quiescenza, probabili perché è più indicativa della funzione glomerulare rispetto a danno di tessuto del rene (31-33).
Un altro studio ha esplorato i livelli assoluti di dd-cfDNA nei destinatari del trapianto del rene relativi ai livelli di tacrolimi, un immunosoppressore (33). Qui, i ricercatori hanno trovato che la quantità elevata assoluta del dd-cfDNA era sostanzialmente in pazienti con i tacrolimi più bassi livella (<8> laboratori inoltre hanno proposto le alternative al gruppo di lavoro. Il nostro ordinamento mirato a esplorato gruppo di 124 (frequenza allelica secondaria [MAF] >0.4) SNPs altamente polimorfico facendo uso di un pannello disponibile nel commercio, ordinamento di prossima generazione e un algoritmo novello (34). Questo approccio ha ridotto significativamente la somma totale di ordinamento i costi ed il tempo richiesto e diminuente di analisi e permettere dell'analisi rapida. Tuttavia, poiché questa analisi conta sulle differenze in MAF fra gli individui, non sarebbe robusto per le paia strettamente connesse del donatore-destinatario, come visto nella donazione in relazione con del rene. Resta convalidare per la rilevazione degli eventi moderati o maggiori di rifiuto.
I laboratori inoltre hanno esplorato facendo uso di SNPs polimorfico per quantificare il dd-cfDNA combinato con la tecnologia della PCR digitale della gocciolina (30,35-37). Facendo uso di 41 SNPs altamente polimorfico, il rene stabile ed i destinatari del GH hanno mostrato le frazioni dd-cfDNA di 2%-3% con i destinatari stabili del trapianto del fegato che hanno un livello di 7% (35).
CONCLUSIONI
L'uso di una biopsia costosa e dilagante del tessuto individuare il rifiuto dell'allotrapianto presenta le limitazioni significative. Come tale, un'analisi come minimo dilagante che può valutare direttamente ed esattamente la salute di intero organo trapiantato rappresenta un sacro Graal nel trapianto solido dell'organo.
L'uso di cfDNA dopo che il trapianto ha indicato una certa promessa iniziale, ma più ulteriormente studia e la convalida è richiesta per migliorare la nostra comprensione sia della biologia di base di cfDNA come pure del suo post-trapianto di comportamento. Attualmente, è chiaro che le differenze organo-specifiche importanti esistono ed i modelli del rilascio del cfDNA possono anche differire secondo il tipo di evento di rifiuto. Tuttavia, il cfDNA rappresenta uno delle tecnologie di promessa eppure sviluppato per complementare o persino infine sostituire la biopsia del tessuto.